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手持超声波破碎机细胞时的若干问题

时间:2020-12-21 浏览:8

大肠杆菌表达外源蛋白,在超声破碎的时候,用含有1%triton-X-100的PBS悬浮,然后超声的效果较好,1%triton-X-100的作用还是很明显的,手持超声波破碎机对其他的一些细菌同样起作用,比如链霉菌。细菌沉淀直接加样品1buffer,再加5ul的巯基乙醇,混匀,离心,煮沸10min,直接上样,染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。在表达重组蛋白后超声波破碎细胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一会就产生大量泡沫,影响了破碎功率,pbs和tris缓冲液都是这样,zui后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。


1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部,约1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根据仪器不同会有所不同,但你可以观察液面,有波动但不要太剧烈就好。


2*破3S停10S,破个二三十次看看。 


3*变幅杆位置摆放也要注意,听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时试着加大体积,强度不要超过60%. 


4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说,你的方法很难散热,导致蛋白变性产生气泡,停顿时间稍长一些,这种情况多见于包涵体形式的蛋白。


链霉菌(放线菌)超声波破碎的手持超声波破碎机,用的方法条件是什么?


前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。


使用超声破碎时采用的具体条件是:


(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r/min 下离心5 min收集菌体.


(2)用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次,再用该缓冲液将菌体配成1:3的菌悬液.置于40 mL大塑料试管内.


(3)将大塑料试管置于冰浴中,采用超声波破碎(功率200 W,1/2”探头,破碎30 s,间歇30 S).


(4)破碎液于12 000 r/min下高速冷冻离心30 min,收集细胞碎片和上清夜.超声破菌流程与 上述基本一致,就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris-HCl,洗涤一次就可以。另外,超声剂量随样品量、菌体改变比较大,功率可以到400-600w,超5s,停5s,冰浴,要加终浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数,有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。